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Biologia das Comunicações volume 5, número do artigo: 1206 (2022) Citar este artigo 3909 Acessos 4 Detalhes da Altmetric Metrics Análise da fosforilação dirigida por agonistas de receptores acoplados à proteína G

Biologia das Comunicações, volume 5, número do artigo: 1206 (2022) Citar este artigo

3909 Acessos

4 Altmétrico

Detalhes das métricas

A análise da fosforilação dirigida por agonistas de receptores acoplados à proteína G (GPCRs) pode fornecer informações valiosas sobre o estado de ativação do receptor e a farmacologia do ligante. No entanto, até o momento, a avaliação da fosforilação do GPCR utilizando aplicações de alto rendimento tem sido um desafio. Desenvolvemos e validamos um imunoensaio baseado em esferas para a avaliação quantitativa da fosforilação de GPCR induzida por agonista que pode ser realizada inteiramente em placas de cultura celular de múltiplos poços. O ensaio envolve imunoprecipitação de receptores marcados por afinidade usando esferas magnéticas seguida de detecção de proteínas usando anticorpos anti-GPCR específicos do estado de fosforilação e independentes do estado de fosforilação. Como prova de conceito, cinco GPCRs prototípicos (MOP, C5a1, D1, SST2, CB2) foram tratados com diferentes agonistas e antagonistas, e curvas concentração-resposta foram geradas. Em seguida, estendemos nossa abordagem para estabelecer ensaios seletivos de inibidores de GPCR quinase celular (GRK), o que levou à rápida identificação de um inibidor seletivo de GRK5/6 (LDC8988) e um inibidor pan-GRK altamente potente (LDC9728). Em conclusão, este ensaio versátil de fosforilação de GPCR pode ser usado extensivamente para perfil de ligantes e triagem de inibidores.

Os receptores acoplados à proteína G (GPCRs) são transdutores de sinais vitais que medeiam os efeitos de uma variedade de estímulos químicos e físicos e representam os principais alvos de medicamentos para muitas doenças humanas. Os GPCRs têm uma estrutura uniforme com sete domínios transmembranares e, portanto, também são chamados de receptores sete transmembranares (7TMRs). A ativação por seus ligantes endógenos ou agonistas exógenos leva a alterações conformacionais do GPCR que são reconhecidas por uma família de quinases denominadas quinases receptoras acopladas à proteína G (GRKs) . A capacidade única dos GRKs de reconhecer receptores ativados resulta em fosforilação dependente de agonista em resíduos intracelulares de serina e treonina . Além disso, as quinases reguladas pelo segundo mensageiro também podem participar na fosforilação do GPCR, incluindo as proteínas quinases A e C e outras serina/treonina quinases . A fosforilação de GPCRs é um processo biológica e farmacologicamente importante que inicia principalmente a dessensibilização e internalização de um receptor7,8. A fosforilação também aumenta a interação dos GPCRs com proteínas adaptadoras intracelulares, como as β-arrestinas, que podem desencadear uma segunda onda de sinalização9,10,11,12.

Os estudos iniciais de GPCR basearam-se em ensaios radioactivos de fosforilação de células inteiras, que requerem elevados níveis de radioactividade e não podem ser utilizados para identificar resíduos individuais de serina e treonina fosforilados. Posteriormente, os estudos foram direcionados para análises fosfoproteômicas, por meio das quais foram obtidas informações quantitativas limitadas13. Atualmente, a abordagem predominante baseia-se em anticorpos que reconhecem especificamente o estado fosforilado de um GPCR14,15,16,17,18. Quando disponíveis, os anticorpos anti-GPCR específicos para fosfosito são excelentes ferramentas para resolver a dinâmica temporal e espacial da fosforilação do receptor, identificar quinases e fosfatases relevantes, detectar a ativação do receptor e traçar o perfil das propriedades farmacológicas de novos ligantes . No entanto, os anticorpos específicos para fosfosito são predominantemente utilizados em abordagens de imunotransferência que são tecnicamente desafiadoras, limitadas a amostras pequenas e difíceis de quantificar.

Na investigação farmacêutica e académica, são frequentemente necessários ensaios de alto rendimento para facilitar a triagem de grandes bibliotecas químicas. Embora a ligação ao receptor, a sinalização da proteína G e o recrutamento da prisão possam ser avaliados com as metodologias disponíveis, atualmente não estão disponíveis tecnologias adequadas para a determinação da fosforilação do GPCR. Estávamos, portanto, motivados a aproveitar os anticorpos anti-GPCR específicos para fosfosita no desenvolvimento de um imunoensaio quantitativo de fosforilação que pode ser realizado inteiramente em placas de cultura de células multipoços e é propício para aplicações de médio a alto rendimento (Fig. 1). Dado que este ensaio pode ser adaptado a praticamente todos os sete receptores transmembranares, é referido como 'ensaio de fosforilação 7TM'.

95% confluency. The cells were cultured in the presence or absence of the agonist [D-Ala2,N-MePhe4,Gly-ol]-enkephalin (DAMGO) and then lysed in detergent buffer containing protease and protein phosphatase (PPase) inhibitors. After plate centrifugation, lysates were transferred to U-bottom 96-well plates. MOPs were then immunoprecipitated using mouse anti-HA antibody-coated magnetic beads. After washing the beads under magnetic force, either phosphosite-specific rabbit antibodies that specifically recognized the S375-phosphorylated form of MOP (pS375-MOP) or antibodies that detected MOP in a phosphorylation-independent manner (np-MOP) were added to the cells (Fig. 2a). Primary antibody binding was then detected using commercially available enzyme-labeled secondary antibodies followed by addition of the respective enzyme substrate solution. The color reaction in DAMGO-treated wells was stopped when the optical density (OD) read at 405 nm reached 1.2, typically within 2 to 8 min. Under identical conditions, the OD of untreated wells was approximately 0.2, suggesting that DAMGO-induced S375 phosphorylation of MOP was specifically detected within the optimal dynamic range for 2′-azino-bis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid (ABTS)-based enzyme immunoassay substrates (Fig. 2b). Omission of the magnetic beads or the primary or secondary antibodies or the use of untransfected cells resulted in OD readings of 0.2 or less. When DAMGO was added at different concentrations ranging from 10 nM to 10 µM in wells assayed using the anti-pS375-MOP antibody, we observed increasing OD readings with data points following the typical shape of a sigmoidal concentration–response curve (Fig. 2c). In contrast, all wells assayed using the anti-np-MOP antibody yielded an OD reading of ~0.8, independent of agonist exposure, indicating that all the MOPs had been identified (Fig. 2c). Next, we evaluated the effect of PPase inhibitors with both a pS375-MOP phosphorylation immunoassay and western blot assay with cells cultured in a multiwell plate. For the western blot analysis, cells were cultured and treated in 96-well plates as described and lysed in detergent buffer with or without PPase inhibitors. MOPs were immunoprecipitated with anti-HA magnetic beads. Immunoprecipitates were washed under magnetic force, and receptors were eluted from the beads into SDS-sample buffer by incubating the plates for 25 min at 43 °C. When these samples were immunoblotted with the anti-pS375-MOP antibody, a concentration-dependent increase in S375 phosphorylation was observed in samples cultured with PPase inhibitors but not in samples lysed without PPase inhibitors (Fig. 2d, top panel). When the blot was stripped and reprobed with the np-MOP antibody, similar levels of MOPs were detected in all the samples irrespective of the presence of PPase inhibitors or agonist exposure (Fig. 2d, bottom panel). For the in-well assay, cells were plated and grown, treated and lysed as in the western blot assay, except that the samples were directly immunoassayed in the plate. Similar to the results obtained by immunoblotting, the results of the assay performed with the anti-pS375-MOP antibody revealed a concentration-dependent increase in signal intensity only in the wells with PPase inhibitor-treated samples (Fig. 2e). In contrast, in wells assayed with the anti-np-MOP antibody, similar signals were observed independent of inhibitor or agonist treatment (Fig. 2f). Notably, a high degree of correlation between the concentration–response curves obtained through the immunoblot analysis and immunoassay was found (Supplementary Fig. 1). These results show that the addition of PPase inhibitors during cell lysis was an essential component of the assay. These results also show that anti-pS375-MOP antibody binding depended on agonist-induced receptor phosphorylation, which needed to be protected from PPase digestion during cell lysis. The anti-np-MOP antibody bound to receptors regardless of their phosphorylation status, and hence, using this antibody appeared to be a feasible means of controlling total receptor content./p>